醛糖還原酶測(cè)定
問(wèn)：有關(guān)測(cè)定醛糖還原酶活性時(shí)的反應(yīng)體系有以下幾個(gè)疑問(wèn)：
1、67mmol/l鈉鉀磷酸鹽緩沖液如何配置？也有人 用50mmol/l的磷酸鉀緩沖液二者哪一種更好。
2、整個(gè)反映體系配置須注意哪些問(wèn)題？最后加DL-甘油醛還是NADPH。
3、NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別用多大濃度？請(qǐng)各位指教，謝謝。
答：在測(cè)定酶的活性時(shí)，有時(shí)由于酶的純化不足，導(dǎo)致影響結(jié)果，在檢測(cè)醛糖還原酶活性時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：
（一）其它酶和物質(zhì)的干擾
如組織勻漿中往往含有NADH-細(xì)胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測(cè)定。臨床酶測(cè)定中最典型的例子是血液中丙酮酸對(duì)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定的干擾，由于反應(yīng)體系中含有大量乳酸脫氫酶和NADH，可與丙酮酸反應(yīng)消耗NADH，引起340nm處吸光度下降，假如將此NADH下降也算為ALT活性將引起誤差。
其它如紅細(xì)胞中腺苷酸激酶（AK）對(duì)CK測(cè)定的干擾，在CK的酶偶聯(lián)體系中ADP是CK底物，但它又同時(shí)是AK的底物，二個(gè)酶反應(yīng)都產(chǎn)生ATP，在工具酶（已糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶）作用下都產(chǎn)生NADH引起340nm處吸光度上升，其結(jié)果是CK測(cè)定結(jié)果偏高，為避免此種干擾，所以在反應(yīng)體系中加入AK的抑制劑AMP和二腺苷酸5′磷酸。
（二）工具酶的污染
目前試劑中所用的試劑酶多從動(dòng)物組織或細(xì)菌中提取，不可避免地會(huì)污染有其它酶，如不注意此問(wèn)題，會(huì)引起不正確結(jié)果。更有甚者，有些工具酶中就混有測(cè)定酶，這種情況下，將產(chǎn)生很高的本底。所以所用的工具酶必須很純，并檢查污染酶的含量，例如測(cè)定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶所用的蘋果酸脫氫酶中所含雜的AST時(shí)，按IFCC規(guī)定不應(yīng)超過(guò)0.005％。
（三）非酶反應(yīng)
有些底物不穩(wěn)定，沒(méi)有酶的作用就能自行反應(yīng)，例如ALP的底物磷酸對(duì)硝基酚配成的底物溶液，室溫放置過(guò)夜，即自行水解釋放出對(duì)硝基成黃色。又如測(cè)醛縮酶時(shí)，其底物醛類化合物可以和NAD+起非酶反應(yīng)產(chǎn)生一種具有類似NADH吸收光譜的化合物，給測(cè)定帶來(lái)困難。
（四）分析容器的污染
如沖洗不當(dāng)，分析容器和管道中混雜有各種物質(zhì)，可能影響酶活性，如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。
（五）沉淀形成
使用光學(xué)法監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)時(shí)，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會(huì)引起吸光度變化，引起測(cè)定結(jié)果誤差，此情況常見(jiàn)于底物溶解度低而反應(yīng)體系中底物濃度偏高。可見(jiàn)于用γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺為底物測(cè)GGT時(shí)。
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