質(zhì)粒DNA的提取與鑒定
[ 實驗?zāi)康?nbsp;]
通過本實驗，學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。
[ 實驗原理 ]
堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.0~12.5這個狹窄的范圍內(nèi),線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)Ph至中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，在而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
[ 實驗 儀器 與設(shè)備 ]
1.恒溫培養(yǎng)箱 2.恒溫?fù)u床
3.臺式離心機(最大轉(zhuǎn)速4000rpm) 4.冷凍高速離心機
5.高壓滅菌鍋 6.超凈工作臺
7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip
[ 實驗材料 ]
1.葡萄糖
2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氫氧化鈉
5.十二烷基硫酸鈉(SDS) 6.乙酸鉀
7.冰乙酸 8.氯仿
9.乙醇 10.胰RNA酶
11.氨芐青霉素 12.蔗糖
13.溴酚藍(lán) 14.酚
15.β巰基乙醇 16.鹽酸
17.含pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌
附： 試劑 的配制
1.溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖
5mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)
10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）
2.溶液Ⅱ
0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等體積混合
3.溶液Ⅲ
5mmol/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4.TE緩沖液
10mmol/L Tris·HCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放 -20℃ 冰箱中,用后即放回)
6.胰RNA酶
將RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于 100℃ 加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存于 -20℃ 。
7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴藍(lán)酚
8.酚
[ 實驗步驟 ]
(一) 提取質(zhì)粒
1．將2ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入含質(zhì)粒的大腸桿菌， 37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。
2．取1.5ml培養(yǎng)物倒入微量 離心管 中，4000rpm，離心2min。
3．吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。
4．將細(xì)菌沉淀懸浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10 min。
5．加200μl溶液Ⅱ（新鮮配制），混勻內(nèi)容物，將 離心管 放冰上5 min。
6．加入150μl溶液Ⅲ（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。
7．1200rpm，離心15 min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。
8．向上清中加入等體積酚：氯仿(去蛋白)，反復(fù)混勻，12000rpm，離心5min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中.
9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻后,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
10．用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。
11．加50μl TE緩沖液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解， -20℃ 保存。
（二）瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA
方法參見實驗二
[ 作業(yè) ]
1. 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 的原理是什么？
2. 用 凝膠成像 系統(tǒng)拍照質(zhì)粒DNA電泳圖，并分析電泳所得條帶
[ 實驗安排 ]
共12學(xué)時，學(xué)生（6學(xué)時）
第1天下午 - 第2天上午：配LB培養(yǎng)基，接種，液體培養(yǎng)
第2天下午：質(zhì)粒DNA的提取
第2天晚上：質(zhì)粒DNA的檢測
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