微生物實(shí)驗(yàn)室菌種管理
1. 前言
微生物實(shí)驗(yàn)室菌種處理和保藏程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，使盡可能減少菌種污染和生長(zhǎng)特性的改變。按統(tǒng)一操作程序制備的菌株是微生物試驗(yàn)結(jié)果一致性的重要保證。
目前中國(guó)藥典還在推進(jìn)ICH的國(guó)際協(xié)調(diào)，還沒有達(dá)成菌株互認(rèn)。中美雙報(bào)時(shí)，從減輕工作量考慮，建議黑曲霉用ATCC和CMCC兩種菌株（黑曲霉和巴西曲霉從基因測(cè)序角度來(lái)說(shuō)兩者有不同），其他的用ATCC菌株，以避免申報(bào)時(shí)受影響。
2. 定義
2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株：由中國(guó)食品藥品檢定研究院認(rèn)可，可溯源至中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心（CMCC）或美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）的冷凍干燥菌。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的采用特定保存方法長(zhǎng)期固定保存的菌株，用于傳代及制備工作菌株。
2.3 工作菌株：用標(biāo)準(zhǔn)菌株或傳代用的菌株接種至瓊脂斜面培養(yǎng)或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌株（菌種）。
2.4 菌株的代：將菌株接種至一新鮮培養(yǎng)基，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。
3. 程序
3.1 管理要點(diǎn)：
3.1.1 檢定菌應(yīng)有專人負(fù)責(zé)管理，詳細(xì)做好菌種購(gòu)進(jìn)、使用、傳代、純化、銷毀記錄。
3.1.2 微生物檢驗(yàn)用的檢定菌應(yīng)從來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株，例如美國(guó)菌種收集中心（ATCC）和中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心（CMCC）。
3.1.3 檢定菌可以是安瓿，也可以是標(biāo)明代數(shù)的斜面，或者是凍存管。
3.1.4 菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。
3.1.5 所有菌的暴露操作都必須在生物安全柜中進(jìn)行。
3.2 菌種的購(gòu)進(jìn)、接收登記
3.2.1 由微生物實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要提出采購(gòu)需求，倉(cāng)庫(kù)從上述指定單位訂購(gòu)。
3.2.2 由專人負(fù)責(zé)購(gòu)入菌種的接收登記，所有菌種均由專人上鎖保存。收貨時(shí)，首先應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和名稱及每一支安瓿的完整性。正確無(wú)誤，在專門的菌種登記臺(tái)帳上記錄購(gòu)入菌種名稱、代號(hào)、傳代次數(shù)、來(lái)源、數(shù)量、日期、貯藏條件、保管人，并在菌種容器上貼上標(biāo)簽。登記放入冰箱上鎖保存（斜面與安瓿于2~8℃保藏，凍存管于-20℃保藏，或參照說(shuō)明書條件儲(chǔ)存），在使用時(shí)間進(jìn)行期間核查，-80℃保存的菌株核查時(shí)間一般為2年一次。
3.3 使用工作菌種的名稱、代號(hào)
菌種名稱 | 中國(guó)藥典 | 國(guó)外藥典 | 縮寫 |
菌種編號(hào) | |||
金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | CMCC（B）26003 | ATCC 6538、NCIMB9518、CIP4.83、NBRC13276 | Sa |
銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) | CMCC（B）10104 | ATCC 9027、NCIMB8626、CIP82.118、NBRC13275 | Pa |
大腸埃希菌 (Escherichia coli) | CMCC（B）44102 | ATCC 8739、NMB 8545、CIP 53.126、BRC 3972 | Ec |
乙型副傷寒沙門菌 (Salmonella paratyphi B) | CMCC（B）50094 | ATCC 14028 | Sp |
枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) | CMCC（B）63501 | ATCC 6633、NCIMB8054、CIP52.62、NBRC3134 | Bs |
生孢梭菌 （Clostridium sporogenes） | CMCC（B）64941 | ATCC11437或ATCC19404、NBRC 14293、CIP 79.3、NCTC 532 | Cs |
白色念珠菌 （Candida albicans） | CMCC（F）98001 | ATCC 10231、NCPF3179、IP48.72、NBRC1594 | Ca |
黑曲霉(Aspergillus niger)/巴西曲霉（巴西曲霉） | CMCC（F）98003 | ATCC16404、IMI149007 IP1431.83、NBRC 9455 | An/Ab |
3.4 菌種的傳代、保藏
3.4.1 菌種的傳代
3.4.1.1 菌種的傳代次數(shù)不超過(guò)5代（從菌種保藏中心獲得的凍干菌種管為0代，凍干的原始菌種開啟后復(fù)蘇為第1代）。菌種的復(fù)蘇與傳代接種在陽(yáng)性室生物安全柜操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。
3.4.1.2 試驗(yàn)用菌種的培養(yǎng)傳代方法包括凍干菌復(fù)蘇、斜面菌種傳代、液體接種制備菌懸液、菌液。
3.4.1.3 菌種傳代、保存、使用
3.4.2 菌種的編號(hào)
如5.3表里的菌種的批號(hào)由C/A－菌種拉丁文名稱開頭字母的縮寫（2位）－W（G）傳代次數(shù)（n）－日期（均為2位）－支數(shù)五部分組成，“C”代表“CMCC”，“A”代表“ATCC”，“W”代表工作用菌株，“G”代表標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備用菌種。如：21年2月3號(hào)制備的ATCC金黃色葡萄球菌第三代傳種，工作用菌種和傳種用菌種均需傳1支，則批號(hào)分別為“A-Sa-W3-210203-01”與“A-Sa-G3-210203-01”。其他菌種由菌種第一個(gè)單詞拉丁文名稱開頭兩位+第二個(gè)單詞拉丁文名稱開頭一位（3位）組成，其余部分和2位的保持一致。
3.4.3 菌種的保藏
3.4.3.1斜面低溫保藏法：
經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面上，作為工作菌株（標(biāo)簽樣式參考表1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株標(biāo)簽）。按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙包好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的塞子換成橡膠塞，編號(hào)，貼簽，放在2～8℃左右的冰箱中保藏，銅綠假單胞菌放在室溫下保藏。斜面低溫保藏法有效期為一個(gè)月。
3.4.3.2甘油冷凍管保藏法：
將待保藏菌株接種平板或瓊脂斜面或液體培養(yǎng)基中，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間后。調(diào)整菌液濃度，一般加入微生物數(shù)量為105～107/ml，向已制備好的菌懸液中加含無(wú)菌甘油的TSB培養(yǎng)基（甘油最終濃度20%)，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無(wú)菌小管，貼好標(biāo)簽。制備好的甘油保藏管于-20℃以下保存，有效期為1年；-80℃以下保存，有效期為5年。
3.4.4 檢測(cè)和環(huán)境檢出菌
3.4.4.1 保存范圍：
序號(hào) | 微生物 |
1 | A/B級(jí)出現(xiàn)的超標(biāo)微生物 |
2 | 環(huán)境監(jiān)測(cè)中超出接受標(biāo)準(zhǔn)的微生物 |
3 | 無(wú)菌陽(yáng)性檢出的微生物 |
4 | 模擬灌裝、水系統(tǒng)及微生物限度檢測(cè)超標(biāo)的微生物 |
5 | 實(shí)驗(yàn)室潔凈區(qū)年度優(yōu)勢(shì)菌落 |
6 | 其他需要保存的菌種 |
3.4.4.2 保存方法：以甘油冷凍管保藏法為例，通常適用于需長(zhǎng)期保存的菌種。
? 菌懸液制備：可參照下表
微生物 | 程序 |
細(xì)菌和酵母菌 | 用無(wú)菌接種環(huán)劃取待保藏環(huán)境檢出菌平板上的單菌落至100mL TSB培養(yǎng)基中，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間后（細(xì)菌30～35oC，18-24h，酵母菌20～25 oC，2~3天），將培養(yǎng)結(jié)束的TSB與等體積40%無(wú)菌甘油混合均勻。40%甘油（例如在250mL取樣玻璃瓶中加入40mL甘油和60mL純化水）需經(jīng)121oC蒸汽滅菌15分鐘。 |
霉菌 | 使用移液器吸取5mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液于霉菌平板中，使用無(wú)菌接種環(huán)刮落孢子，收集懸液至15mL或者50mL無(wú)菌離心管中，與等體積40%無(wú)菌甘油混合均勻。 |
? 用移液槍分裝于無(wú)菌甘油冷凍管，每管1.0mL，放于凍存管盒，并作好標(biāo)記，置于-80℃以下超低溫保存箱保存，有效期5年。
? 流水號(hào)和《微生物鑒定登記臺(tái)賬》的流水號(hào)保持一致，以方便溯源，流水號(hào)的命名方式為4位年+兩位月+兩位日+兩位序號(hào)組成，例如2021092001，表示2021年9月20日第一份登記樣品。注：環(huán)境檢出菌在流水號(hào)前加EM方便年度統(tǒng)計(jì)。
? 環(huán)境檢出菌甘油冷凍管編號(hào)：流水號(hào)+編號(hào)（三位阿拉伯?dāng)?shù)字），如EM2021092001-001表示2021年9月20日第一份環(huán)境檢出菌登記樣品第1支甘油冷凍管。
? 填寫《環(huán)境菌制備和使用記錄》。
3.4.5.1商業(yè)派生菌株的保存和有效期參照其使用說(shuō)明執(zhí)行。
3.4.6 菌液和菌懸液有效期
3.4.6.1 培養(yǎng)結(jié)束后，菌液均于2-8℃冰箱中保存（制備好的菌懸液亦同樣保存）。
3.4.6.2 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌、生孢梭菌等的菌液在規(guī)定貯存條件下的有效期為30天。
3.4.6.3 黑曲霉菌液在規(guī)定貯存條件下的有效期為1個(gè)月。
3.4.6.4 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌、生孢梭菌等的菌懸液，若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2~8℃，在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉菌懸液在2~8℃冰箱中保存，有效期為7天。
3.4.7 菌種傳代的記錄寫在《菌種傳代記錄》上，菌懸液記錄寫在《菌懸液制備及使用記錄》上。
3.5 檢定菌的使用
3.5.1 質(zhì)量檢驗(yàn)須使用菌種，由微生物檢驗(yàn)員提出申請(qǐng)，經(jīng)主管同意后向保管人員領(lǐng)取。
3.5.2 非檢驗(yàn)?zāi)康幕蚱渌麊挝灰褂镁N，須得到質(zhì)量部負(fù)責(zé)人的同意。
3.5.3 正常檢驗(yàn)工作，只能使用工作用菌種，商業(yè)派生菌株只能用作工作菌株，從3代開始使用，不超過(guò)5代。
3.5.4 檢定菌種由專人保管，領(lǐng)用人領(lǐng)用菌種，應(yīng)做好菌種領(lǐng)用記錄。
3.6 廢棄菌種、菌懸液、菌液的處理
3.6.1 廢棄菌種、菌懸液、菌液類型
（1）新一代的菌種培養(yǎng)好后，原批號(hào)的傳種用菌種、工作用菌種作為廢棄菌種。
（2）工作用菌種在使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)異常情況時(shí)，作為廢棄菌種。
（3）菌液超過(guò)有效期后作為廢棄菌液。
（4）制備好的菌懸液使用結(jié)束后，即作為廢棄菌懸液。
（5）商業(yè)派生菌株使用結(jié)束后作為廢棄菌液。
3.6.2 廢棄的菌種、菌液、菌懸液于121℃滅菌30分鐘后或126℃滅菌60分鐘棄去。
3.6.2.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌等的菌種在傳種結(jié)束后1～3個(gè)工作日內(nèi)滅菌后棄去。
3.6.2.2 黑曲霉菌種在傳種結(jié)束后1～3個(gè)工作日內(nèi)滅菌后棄去。
3.6.2.3 舊批號(hào)的菌懸液在新批號(hào)的菌懸液制備培養(yǎng)好后2個(gè)工作日內(nèi)滅菌后棄去。
3.6.2.4 菌液使用結(jié)束后，在1～3個(gè)工作日內(nèi)于121℃濕熱滅菌30分鐘或126℃滅菌60分鐘后棄去。
3.6.2.5 所購(gòu)進(jìn)菌種，傳代至第5代用后就需做銷毀處理，并做好詳細(xì)記錄。
3.6.3 按照本公司實(shí)驗(yàn)室廢棄物相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
3.7 記錄
3.7.1 菌種的轉(zhuǎn)種、傳種、使用及滅菌處理必須有文字記錄，記錄內(nèi)容包括操作日期、操作人、復(fù)核人、菌種名稱，廢棄菌種批號(hào)、菌懸液、菌液的處理及有無(wú)異常情況等。
3.7.2 菌種等記錄歸檔保存3年。
3.8 注意事項(xiàng)：
3.8.1 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、以及菌種管的塞子是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。
3.8.2 每當(dāng)移植菌種時(shí)，各菌的編號(hào)、批次及所用培養(yǎng)基，經(jīng)認(rèn)真核對(duì)無(wú)誤。
3.8.3 每次移植培養(yǎng)后，應(yīng)與原種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，檢查培養(yǎng)特征無(wú)誤時(shí)再繼續(xù)保藏。
3.8.4 某些菌種經(jīng)過(guò)冷凍干燥保存后，延遲期較長(zhǎng)，需連續(xù)兩次傳代培養(yǎng)才能正常生長(zhǎng)。
3.8.5 冷凍菌種一旦解凍傳代后，不得重新冷凍和再次使用。
3.8.6 工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過(guò)5代。
