幾種染色劑的使用原理、使用方法歸納
1.甲基綠和吡羅紅:
實驗原理:
甲基綠和吡羅紅兩種染色劑對DNA和RNA的親和力不同,甲基綠使DNA呈現綠色,吡羅紅使RNA呈現紅色.利用甲基綠,吡羅紅混合染色劑將細胞染色,可以顯示DNA和RNA在細胞中的分布.
試劑及配制方法
(1)試劑 質量分數為0.9%的NaCl溶液,質量分數為8%的鹽酸,乙酸鈉,乙酸,蒸餾水,吡羅紅甲基綠混裝粉。如果化學試劑商店沒有吡羅紅甲基綠混裝粉,可以分別購買甲基綠和吡羅紅G,然后按A液的第二種方法配制(見下文)。
(2)染色劑的配制
①染色劑A液的兩種配制方法
第一種方法:取吡羅紅甲基綠粉1 g,加入到100 mL蒸餾水中溶解,然后用濾紙過濾,將濾液放入棕色瓶中備用。
第二種方法:取甲基綠2 g溶于98 mL蒸餾水中,取吡羅紅G 5 g溶于95 mL蒸餾水中。取6 mL甲基綠溶液和2 mL吡羅紅溶液加入到16 mL蒸餾水中,即為A液,放入棕色瓶中備用。(注意:用于核酸染色的是吡羅紅G,請不要錯買吡羅紅B。)
②染色劑B液的配制方法 B液是一種緩沖液,由乙酸鈉和乙酸混合而成。先取乙酸鈉16.4 g,用蒸餾水溶解至1 000 mL備用;再取乙酸12 mL,用蒸餾水稀釋至1 000 mL備用。取配好的乙酸鈉溶液30 mL和稀釋的乙酸20 mL,加蒸餾水50 mL,配成pH為4.8的B液(緩沖液)。
③染色劑的配制染色劑是由A液、B液混合配制而成的。取A液20 mL和B液80 mL混合,就是實驗中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。應該注意的是該試劑應現用現配。
2.龍膽紫和醋酸洋紅: |
染色質(體)容易被堿性染料染成深色。作為染色劑必須具備兩個條件:一是具有顏色;二是要與被染組織間有親和力。染料的顏色和它與組織間的親和力是由染料本身的分子結構決定的,產生顏色的發色基團和與組織間產生親和力的助色基團共同決定了染色劑的染色性質。作為染料物質,除了有發色基團外,還需要有一種使化合物發生電離作用的助色基團。染色劑的酸、堿性界定并非由染料溶液的pH值決定,而是根據染料物質中助色基團電離后所帶的電荷來決定。一般來說,助色基團帶正電荷的染色劑為堿性染色劑,反之則為酸性染色劑。
醋酸洋紅常被用作核、染色體的固定和染色劑。在煮沸的45%醋酸中加洋紅使之飽和,再加入微量的鐵離子,便使醋酸洋紅材料在為醋酸固定的同時,洋紅將核或染色體染成紅色。用龍膽紫可將染色體染成藍紫色。
3.伊紅美藍:伊紅和美藍是兩種苯胺類染料,可以抑制革蘭氏陽性菌的生長。同時,這些染料可以區分那些發酵乳糖的微生物。大腸菌群因其強烈發酵乳糖而產生大量的混合酸,使菌體表面帶上正電荷,可染上伊紅染料,伊紅與美藍結合,菌體被著上深紫色,在含有兩種染料呈紫色的培養基上,形成帶核心、具金屬光澤的菌落。因此可以用伊紅和美藍鑒別革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的存在。
4.二苯胺:
二苯胺是一種非極性芳香族有機分子,有毒,熔點比水低,微溶解于水,易溶解于酒精、冰乙酸等有機溶劑。化學性質活潑,遇光易變色。因此要放置于暗處保存。
二苯胺試劑鑒定DNA的原理:DNA分子中的脫氧核糖在酸性環境下生成ω-羥基-γ-酮基戊醛,再與二苯胺試劑結合顯藍色,顏色的深淺與溶液中的DNA含量成正比。
二苯胺試劑的配制:A液:1.5克二苯胺溶解于100ml冰乙酸中,在加入1.5ml濃硫酸(此處濃硫酸的作用可能是作為強氧化劑來維持試劑的穩定),配制好的A液保存在棕色瓶中。B液:體積分數為0.2%的乙醛。由于乙醛是一種還原性試劑,所以實驗前不能將A液和B液混合在一起。同時因為二苯胺試劑性質不穩定,極易變色,因此建議現配現用。
5.雙縮脲:鑒定生物組織中是否含有蛋白質時,常用雙縮脲法,使用的是雙縮脲試劑,發生的是雙縮脲反應。雙縮脲反應實質是在堿性環境下的銅離子與雙縮脲試劑發生的紫色反應。而蛋白質分子中含有很多與雙縮脲(H2NOC-NH-CONH2)結構相似的肽鍵,所以蛋白質都能與雙縮脲試劑發生顏色反應,可以用雙縮脲試劑鑒定蛋白質的存在。
6.斐林試劑:由氫氧化鈉 的質量分數 為0.1 g/mL的溶液和硫酸銅 的質量分數為0.05 g/mL的溶液,還有酒石酸鉀鈉配制而成的。它與可溶性的還原性糖 (葡萄糖 )、果糖 和麥芽糖 )在加熱的條件下,能夠生成磚紅色的氧化亞銅 沉淀 。因此,斐林試劑常用于鑒定可溶性的還原性糖的存在與否。
7.班氏試劑:
班氏試劑常用于尿糖的鑒定,其配方與斐林試劑不一樣,其配方為:
①400ml水中加85g檸檬鈉和50g無水碳酸鈉;
②50ml加熱的水中加入8.5g無水硫酸銅。制成溶液;
③把溶液倒入檸檬酸鈉溶液中,邊加邊攪,如產生沉淀可濾去。
(2)其反應原理與斐林試劑略有差別。利用斐林試劑鑒定時,斐林試劑甲和斐林試劑乙直接反應生成和可溶性還原糖反應產生磚紅色沉淀。而班氏試劑中的產生卻是這樣的:檸檬酸鈉和碳酸鈉均為強堿弱酸鹽,在水中它們均可水解產生,與檸檬酸鈉溶液和溶液混合時,結合,生成與葡萄糖中的醛基反應生成磚紅色沉淀。
(3)兩種試劑的保存方式不同。斐林試劑甲和斐林試劑乙可強烈產生,很容易沉淀析出,因此斐林試劑一般為現用現配;而班氏試劑的配方中,檸檬酸鈉為一對緩沖物質,產生的數量有限,與溶液混合后產生的濃度相對較低,不易析出,因此該試劑可長期保存。
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