手把手教你設計 siRNA
自 1998 年 Fire 和 Mello 首次提出 RNAi(RNA interference，RNA 干擾) 概念以來，越來越多的人開始重視小 RNA 的研究，之后 RNAi 在基因功能的研究中也得到廣泛應用。RNAi 是一種存在于真核生物中的轉錄后基因沉默現象，在生物進化過程中能夠抵御病毒感染及防止基因組中由于逆轉座子元件擴增引起的不穩定。
在 miRNA(microRNA)、siRNA(small interfering RNA) 等小 RNA 的介導下，RNAi 能夠特異性地調控 mRNA 基因在表觀遺傳學水平、轉錄水平及轉錄后水平的表達。
小干擾 RNA(Small interfering RNA;siRNA) 與靶向特異性的 mRNA 結合，通過 RNA 介導的沉默復合體 RISC(RNA-induce siliencing complex) 介導 mRNA 的降解。siRNA 長度一般為 21 - 23nt，被 RISC 識別結合之后，siRNA 發生解旋。RISC 在 siRNA 的反義鏈指導下，尋找具有同源序列的內源性的 mRNA，并在距離 5』端 10 - 11 位堿基之間切割 mRNA，從而導致轉錄后基因沉默。
siRNA 設計原則
RNAi 最終要通過 siRNA 片段與靶基因結合并使之降解，因此，確保高度同源于靶基因而絕無與其他基因同源的 siRNA 序列，是決定 RNAi 特異性的關鍵所在，也是 siRNA 設計的基本原則。從具有不同沉默效率的 siRNA 序列中篩選出高效的 siRNA 序列，需要經過嚴密的設計和不斷的實驗檢驗。下面我們就來看下 siRNA 設計要遵循哪些原則：
1.siRNA 序列在靶基因中的位置
從靶基因起始密碼子 AUG 下游 50～100 個核苷酸開始搜尋理想的 siRNA 序列，越靠近靶基因的 3′端，其基因沉默效果可能越好。
2. siRNA 序列的起始堿基與長度
SiRNA 序列最好為 AA(N n)UU(N 代表任意堿基;n 為堿基數目，在 19～29 nt 之間)， NA(N n) UU 和 NA(N n) NN 序列也可以。最新研究表明 ，27 nt 或 29 nt 的 siRNA 與 21 nt siRNA 相比 27 nt SiRNA 對靶基因的最大抑制率可在相對低的濃度下得到。
3 .siRNA 3′端突出堿基的選擇
建議用 dTdT 取代 3′端的 2 個堿基突出，增強 siRNA 雙鏈復合體的穩定性。
4 .siRNA 序列中 G/ C 含量的選擇
G/C 含量在 30%～52% 的 siRNA 序列，其沉默基因效果較好。
5 .siRNA 中應避免連續的單一堿基和反向重復序列
因為連續 2 個以上的 G 和 C 可以降低雙鏈 RNA 的內在穩定性，從而抑制 RNAi 作用；連續 3 個以上的 U 和 A 可能終止由 RNA Polymerase III 介導的轉錄。siRNA 序列中的重復序列或回文結構可能形成發夾狀結構，這種結構的存在可以降低 siRNA 的有效濃度和沉默效率。
6 .siRNA 雙鏈的內在穩定性
反義鏈 5端的第一個堿基盡量為 A 或 U;siRNA 正義鏈的 5端第一個堿基盡量為 G 或 C。
7. siRNA 正義鏈的堿基偏愛性
正義鏈的第一位和第十九位堿基為 A; 正義鏈的第十位堿基為 U; 正義鏈的第十三位堿基不為 G; 正義鏈的第十九位堿基不為 G 或 C 時，siRNA 序列具有較高的基因沉默效率。
8 .siRNA 序列的特異性
目前沒有發現 siRNA 的干擾效率與 mRNA 中具體位置的關系，為確保對靶 mRNA 的有效抑制，針對每一個靶基因結合上述 siRNA 設計原則選擇靶點相差 25bp 以上的 4 星半以上的至少 3 條序列。
siRNA 設計步驟
首先在 NCBI 上找到靶基因的目的片段，如果靶基因有多個轉錄本就需要把所有 NM 號所對應的 CDS 序列放在 clone Manager 中比對，并選擇擁有序列 CCDS 進行設計。
目前沒有發現 siRNA 的干擾效率與 mRNA 中具體位置的關系，為確保對靶 mRNA 的有效抑制，針對每一個靶基因結合上述 siRNA 設計原則選擇靶點相差 25bp 以上的 4 星半以上的至少 3 條序列。隨后將 siRNA 片段進行 Blast 分析，盡量選擇與靶基因特異結合的序列，進行化學合成后，通過實驗篩選出沉默效率最高的 siRNA 序列進行下一步的基因功能研究。
PS: 需要注意的是，有的 siRNA 序列在設計時沒有遵守這些指導方針，實驗證明也具有很高的干擾效應，這表明，我們只能根據上述指導方針設計出理論上具有較高沉默效應的 siRNA 序列，siRNA 的最終活性需要用實驗來驗證 。
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