多肽合成的背景與應(yīng)用
一、背景
多肽合成是一個固相合成順序一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。多肽合成總的來說分成兩種：固相合成和液相多肽合成。
多肽是一種與生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)的總稱，常常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
多肽合成方法是把不同的或相同的多個氨基酸按指定順序連結(jié)起來構(gòu)成肽鏈(含多個肽鍵-CONH-)化合物的合成方法。由德國化學(xué)家費舍爾(E.Fischer)所首創(chuàng)。進行多肽合成，必須首先解決兩個問題：①要將氨基酸兩個官能團中的一個(通常選氨基)封閉，即用保護基團保護起來，只讓沒被保護的那個基團(羧基)去同另一個氨基酸分子反應(yīng)。采用的保護基團不僅要易于同被保護基團發(fā)生反應(yīng)，還須在肽鍵形成后易去除。②要活化沒被封閉的官能團，使之能在較溫和的條件下發(fā)生反應(yīng)?？勺鳛榘被Ｗo試劑的有氯甲酸芐酯和叔丁氧甲酰氯等，用來活化羧基的方法則是將羧基變成酰氯、酯、混合酸酐等衍生物或加縮合劑(失水劑)二環(huán)已基碳酰二亞胺，使氨基和羧基結(jié)合起來。
二、應(yīng)用
用于基于一種新型疏水載體輔助的液相多肽合成法的索馬魯肽制備工藝研究：
索馬魯肽是一個含有一條長脂肪側(cè)鏈的三十一肽,通過將GLP-1受體激動劑利拉魯肽（Liraglutide）結(jié)構(gòu)上的8位谷氨酸殘基（Glu）替換成了2-氨基異丁酸殘基（Aib）以及將27位賴氨酸殘基上的6位氨基連接的軟脂酰谷氨酸替換成了由兩個8-氨基-3,6-二氧雜辛酸（AEEA）、谷氨酸（Glu）和十八烷二酸偶聯(lián)而成的長脂肪鏈而制得。作為一種多肽類藥物,索馬魯肽的合成方法與其他多肽類藥物類似,主要通過固相合成法制備。
考慮到固相合成法存在的一些缺點以及索馬魯肽結(jié)構(gòu)的特點（它含有一條長脂肪側(cè)鏈,其合成原料價格昂貴）,我們嘗試將一種新型基于疏水載體輔助的液相肽合成法用于索馬魯肽的合成,并在此基礎(chǔ)上進行工藝優(yōu)化。這種新方法的原理類似于傳統(tǒng)固相合成法,也是將多肽C末端的氨基酸與載體偶聯(lián),然后通過逐個偶聯(lián)的方式得到所需片段,最后通過裂解得到產(chǎn)物。
然而,該方法與固相合成法具有明顯本質(zhì)區(qū)別:其所使用的載體在非極性溶劑中高度易溶,而在極性溶劑中難溶;偶聯(lián)和脫保護反應(yīng)為均相反應(yīng),可在溶液中進行,能通過TLC法進行簡單直觀的監(jiān)測,有效減少了雜質(zhì)的產(chǎn)生;當(dāng)反應(yīng)完成后,只需向反應(yīng)液中加入不良溶劑即可析出產(chǎn)物結(jié)晶,分離純化步驟像固相合成法一樣易于處理;由于是均相反應(yīng),其氨基酸以及催化劑的投料量更加合理,無須像固相合成法那樣大幅過量,這在很大程度上降低了制備成本。
基于該方法的特點和索馬魯肽結(jié)構(gòu)性質(zhì),我們將索馬魯肽分為以下六個片段:Boc-His（Trt）-Aib-Glu（OtBu）-Gly-OH（片段1）、Fmoc-Thr（tBu）-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-OH（片段2）、Fmoc-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-OH（片段3）、Fmoc-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys[-AEEA-AEEA-γ-Glu（α-OtBu）-Oct（OtBu）]-Glu（OtBu）-Phe-OH（片段4）、Fmoc-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-OH（片段5）、Fmoc-Val-Arg（Pbf）-Gly-Arg（Pbf）-Gly-OH（片段6）。
選擇2,4-二（二十二烷氧基）苯甲醇作為可溶性疏水載體,將氨基酸的羧基通過酯化反應(yīng)偶聯(lián)到載體的醇羥基上,并通過Fmoc保護法依次偶聯(lián)氨基酸得到六個Fmoc保護的連有載體的片段:Tag-片段1-6。然后分別脫去Tag-片段1-5的載體,并在Tag-片段6的基礎(chǔ)上依次按片段5-1的順序（即索馬魯肽主鏈C末端到N末端的順序）偶聯(lián)得到Tag-全保護索馬魯肽,最終通過裂解和制備液相純化得到索馬魯肽。
在索馬魯肽的合成研究中,由于片段4結(jié)構(gòu)中賴氨酸殘基（Lys）的氨基上連有長脂肪側(cè)鏈,我們選用Alloc-Lys（Fmoc）-OH作為片段上賴氨酸殘基的原料。當(dāng)偶聯(lián)至此氨基酸殘基時,首先脫去Fmoc保護基并使用側(cè)鏈所需要的三種原料依次偶聯(lián)合成側(cè)鏈,然后脫去Alloc保護基并偶聯(lián)主鏈上剩余的氨基酸殘基得到片段4。
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