抗體親和純化洗脫液的應用
一、概述
抗體是機體對體內存在的外來分子、微生物的抗原物質刺激，由Ｂ淋巴細胞分化的漿細胞產生的一類糖蛋白，可以是以與膜結合的形式作為抗原受體結合于B細胞表面；也可以是以分泌的形式存在于血液或體液中，作為特異性體液免疫的效應分子，參與清除抗原過程中的分子間相互作用。
抗體作為一種特殊的蛋白質分子，近年來作為藥物、體外診斷試劑、免疫親和層析配基、藥物載體工具等得到了長足的發展，同時抗體也在醫學、生命科學、生物工程等領域有著廣泛的應用。
二、緩沖液的配制
平衡緩沖液:pH 7.4, 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (PBS, 分別含0.15、0.25、0.3、0.75 mol/LNaCl) 。洗脫緩沖液:pH 2.8, 0.1 mol/L甘氨酸緩沖液。中和緩沖液:pH 9.0, 1 mol/L Tris-HCl緩沖液。
一些純化載量較少的抗體可適當提高需平衡緩沖液中的鹽濃度 (可達3 mol/L) 和pH值 (可達pH 8.2) , 以提高抗體和介質的吸附力。但是, 有時高pH會增加雜蛋白吸附, 使用時應根據實際情況調節。
以上緩沖液使用前均需經0.45μm濾膜過濾。
三、應用
(a) 裝柱:偶聯了重組蛋白A的Sepharose4FF填料裝柱后, 用洗脫緩沖液洗3~5個柱床體積洗掉乙醇和雜質, 用平衡緩沖液流洗5~10個柱床體積平衡柱。
(b) 上樣:將含免疫抗體IgG的兔血清樣品上柱, 均勻上樣, 可將流出液反復上樣, 以更好地結合IgG (樣品先用平衡緩沖液稀釋5~10倍, 以保證樣品液的pH和平衡緩沖液接近) 。
(c) 洗滌:用平衡緩沖液再洗5~10個柱床體積, 直至基線趨于平緩。
(d) 洗脫:分別以相對快速和慢速加入洗脫緩沖液, pH降至約3.0, IgG從填料上洗脫下來, 立即用上述中和緩沖液中和洗脫液至pH為中性, 防止洗脫緩沖液的酸性環境引起抗體失活。
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