紫外吸收法測定核酸的含量
一、目的
學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度計的基本原理和使用方法。
二、原理
核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)（-C=C一C=C-），能夠強(qiáng)烈吸收250-280nm 波長的紫外光。
核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 處。
遵照Lambert-Beer 定律，可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質(zhì)的含量。
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異，它們的摩爾消光系數(shù)也隨之不同。
所以，在測定核酸物質(zhì)時均應(yīng)在固定的pH溶液中進(jìn)行。
核酸的摩爾消光系數(shù)（或吸收系數(shù)），通常以ε（ρ）來表示，即每升含有一摩爾核酸磷的溶液在260nm 波長處的消光值（即光密度，或稱為光吸收）。核酸的摩爾消光系數(shù)不是一個常數(shù)，而是依賴于材料的前處理、溶液的pH 和離子強(qiáng)度發(fā)生變化。它們的經(jīng)典數(shù)值（pH = 7.0）如下：
DNA 的ε（ρ）= 6 000 - 8 000
RNA 的ε（ρ）= 7 000 - 10 000
小牛胸腺DNA 鈉鹽溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 6 600，DNA 的含磷量為9.2%，含1μg/mL DNA 鈉鹽的溶液光密度為0.020。
RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量為9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度為0.022-0.024。
采用紫外分光光度法測定核酸含量時，通常規(guī)定：在260nm 波長下，濃度為1μg/mL 的DNA 溶液其光密度為0.020，而濃度為1μg/mL 的RNA 溶液其光密度為0.024。
因此，測定未知濃度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可計算測出其中核酸的含量。
該法簡單、快速、靈敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可測出。
對于含有微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)的核酸樣品，測定誤差較小，若樣品內(nèi)混雜有大量的上述吸收紫外光物質(zhì)，測定誤差較大，應(yīng)設(shè)法事先除去。
由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高約40%，這就是眾所周知的增色效應(yīng)（hyperchromic effect）。
在大分子的核酸中，氫鍵和π-鍵相互作用改變了堿基的共振行為。
因此，核酸的光密度低于構(gòu)成它的核苷酸的光密度，該現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)（hypochromic effect）。
三、實驗材料、主要儀器和試劑
1.試材：核酸樣品DNA 或RNA。
2. 主要儀器
（1）分析天平
（2）紫外分光光度計
（3）冰浴或冰箱
（4）離心機(jī)
（5）離心管（10mL）
（6）燒杯（10mL）
（7）容量瓶（50mL、100mL）
（8）移液管（0.5ml、2mL 和5mL）
（9）藥品勺和玻璃棒
（10）試管和試管架。
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