用siRNA沉默基因
RNAi 在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，其基礎(chǔ)是 siRNA 的基因沉默作用。目前在體內(nèi)或體外 RNAi 中應(yīng)用的 siRNA 主要有兩類： RNA 和 DNA 載體。
1 、 RNA
（ 1 ） siRNA ：化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄的方法得到 ~21nt 的兩段小 RNA ，經(jīng)退火后形成 ~19 個堿基互補(bǔ)，兩邊 3? 端各有 2 個堿基突出的 siRNA 。目前此類 siRNA 應(yīng)用最廣泛。尤其是經(jīng)過修飾后提高穩(wěn)定性的 siRNA 仍可表現(xiàn)特異的基因沉默作用，為其在體內(nèi)的應(yīng)用提供了可能的前景。
（ 2 ） esiRNA ：因為上述的 siRNA 基因抑制的有效性關(guān)鍵在于靶基因序列片段的選擇，但現(xiàn)在并不知道 mRNA 的哪一個部位對 siRNA 更敏感，所以根據(jù)靶基因 mRNA 設(shè)計的長 dsRNA 經(jīng) Dicer 剪切成一系列 ~21nt 的 siRNA －統(tǒng)稱為 esiRNA ，可能更有效、更方便的抑制基因的表達(dá)。
（ 3 ）發(fā)夾 RNA ：根據(jù) miRNA 設(shè)計的發(fā)夾 RNA ，或基于 siRNA 的發(fā)夾 RNA 在體內(nèi)都表現(xiàn)出有效地基因抑制作用。
2 、 DNA 載體
由于在哺乳動物和果蠅中不存在 RNAi 的擴(kuò)增機(jī)制，導(dǎo)入以上 RNA 產(chǎn)生的 RNAi 作用不可避免的具有瞬時性。為了克服這個弱點，一些研究小組發(fā)展了基于 DNA 載體在體內(nèi)表達(dá) siRNA 的技術(shù)。這種載體可以是質(zhì)粒，也可以是病毒，甚至可以是 DNA 片段。
（ 1 ）基于 RNA 聚合酶 II 啟動子的表達(dá)系統(tǒng)：在弱或無干擾素應(yīng)答反應(yīng)的組織或細(xì)胞中，可以構(gòu)建長的發(fā)夾 RNA ，進(jìn)一步由 Dicer 剪切成 siRNA 。這種表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點是允許組織或細(xì)胞特異性的 dsRNA 表達(dá)，但是絕大部分哺乳動物細(xì)胞對長的發(fā)夾 RNA 的干擾素應(yīng)答而產(chǎn)生非特異作用，限制了此類表達(dá)系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用。
（ 2 ）基于 RNA 聚合酶 III 啟動子的表達(dá)系統(tǒng)：目前主要應(yīng)用的是 U6 啟動子和 H1 啟動子，一方面它們在體內(nèi)有較高的轉(zhuǎn)錄效率，另一方面以數(shù)個連續(xù) T 為終止信號，限制了 RNA 的大小從而不引起干擾素的非特異作用。此種表達(dá)系統(tǒng)還可分成三類：一是基于發(fā)夾 RNA 的基因沉默效應(yīng)而設(shè)計的表達(dá)發(fā)夾 RNA 的質(zhì)粒載體；二是在載體上構(gòu)建兩個啟動子分別表達(dá) siRNA 的正義 RNA 和反義 RNA ；三是共同導(dǎo)入分別表達(dá) siRNA 的互補(bǔ)片段的含有 U6 或 H1 啟動子的 DNA 片段，或者表達(dá)發(fā)夾 RNA 的 DNA 片段。尤其是后者，可以用 PCR 方法方便的獲得，大大擴(kuò)展了其應(yīng)用。
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