氨基酸的紙層析
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1.了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。
2.學(xué)習(xí)紙層析法的操作技術(shù)，分析未知樣品氨基酸的成分。
二、 實(shí)驗(yàn)原理
用濾紙為支持物進(jìn)行層析的方法，稱(chēng)為紙層析法，它是分配層析法的一種。紙層析所用的展層溶劑大多是由水飽和的有機(jī)溶劑組成。濾紙纖維的—OH 基的親水性基團(tuán)，可吸附有機(jī)溶劑中的水作為固定相，有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，它沿濾紙自下向上移動(dòng)，稱(chēng)為上行層析；反之，使有機(jī)溶劑自上而下移動(dòng)，稱(chēng)為下行層析。
將樣品點(diǎn)在濾紙上進(jìn)行展層，樣品中的各種氨基酸即在二相中不斷進(jìn)行分配，由于它們各自的分配系數(shù)不同，故在流動(dòng)相中移動(dòng)速率不等，從而使不同的氨基酸得到分離和提純。
紙層析法主要是依據(jù)混合組分對(duì)二相分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離，但亦存在著某種程度的吸附作用和離子交換現(xiàn)象。氨基酸經(jīng)層析在濾紙上形成距原點(diǎn)不等的層析點(diǎn)，氨基酸在濾紙上的移動(dòng)速率用R f 表示。
R f = 原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離
只要實(shí)驗(yàn)條件(如溫度、展層溶劑的組分、pH、濾紙的質(zhì)量等)不變，R f 值是常數(shù)，因此可做定性分析參考。
如果溶質(zhì)中氨基酸組分較多或其中某些組分的Rf 值相同或近似，用單向?qū)游霾灰藢⑺鼈兎珠_(kāi)，為此可進(jìn)行雙向?qū)游觯诘谝蝗軇┱归_(kāi)后將濾紙轉(zhuǎn)動(dòng)90度，以第一次展層所得的層析點(diǎn)為原點(diǎn)，再用另一種溶劑展層，即可達(dá)到分離目的。由于氨基酸無(wú)色，可利用茚三酮反應(yīng)使氨基酸層析點(diǎn)顯色，從而定性和定量。
三、 儀器和試劑
儀器
層析濾紙、燒杯、剪刀、層析缸、培養(yǎng)皿、猴頭噴霧器、微量加樣器或毛細(xì)管、吹風(fēng)機(jī)一個(gè)、直尺、鉛筆等。
試劑
1.混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉)
甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶于5mL 水中。
蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于5mL 水中。
亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于5mL 水中。
氨基酸混合液： 甘氨酸50mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg 共溶于5mL 水中。
2.展層溶劑
堿相溶劑：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇 = 13∶13∶13(V/V)
酸相溶劑：正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(V/V)，搖勻后放置半天以上，取上清液備用。
3.顯色貯備液： 0.4mol/L 茚三酮—異丙醇∶甲酸∶水=20∶1∶5。
4.0.1%硫酸銅：75%乙醇=2∶38，臨用前按比例混合。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
(1)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸單向上行層析法
1.畫(huà)基線(xiàn)
戴上指套或橡皮手套，在長(zhǎng)約20cm、寬約17cm 濾紙上，距短邊2.5cm 處，用鉛筆畫(huà)一條線(xiàn)，即為基線(xiàn)。
2.點(diǎn)樣
在原線(xiàn)上，從距紙的長(zhǎng)邊4cm處開(kāi)始，每隔3cm 用微量注射器或毛細(xì)管依次分別點(diǎn)上甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和混合氨基酸溶液。點(diǎn)樣點(diǎn)干后可重復(fù)點(diǎn)加1～2次。每一點(diǎn)的直徑不超過(guò)2mm，點(diǎn)樣量以每種氨基酸含5～20ug 為宜。
3.展層
將點(diǎn)好樣的濾紙卷成筒形，濾紙兩邊不相接觸，用線(xiàn)固定好，將原線(xiàn)的下端浸入盛有溶劑的培養(yǎng)皿中，不需平衡可立即展層。
展層劑為酸性溶劑系統(tǒng)，在展層溶劑中加入顯色貯備液(每10mL 展層劑加0.1～0.5mL 的顯色貯備液)進(jìn)行展層，基線(xiàn)必須保持在液面之上，以免氨基酸與溶劑直接接觸。蓋好層析缸，當(dāng)溶劑前沿距紙端2cm 時(shí)(大約3h)，取出濾紙。
4.顯色
濾紙取出后，吹干或在80℃左右烘箱內(nèi)烘3～5min，即出現(xiàn)紫紅色的氨基酸層析斑點(diǎn)。用鉛筆劃下層析斑點(diǎn)，可進(jìn)行定性、定量測(cè)定。
(2)混合氨基酸雙向上行紙層析法
1.濾紙準(zhǔn)備
將濾紙裁成約28cm 2 的正方形，在距濾紙相鄰兩邊各2cm 處的交點(diǎn)上，用鉛筆劃下一點(diǎn)，做為原點(diǎn)。
2.點(diǎn)樣
取混合氨基酸溶液(5mg/mL)10～15μL，分別點(diǎn)在原點(diǎn)上。
3.展層與顯色
將點(diǎn)好樣的濾紙卷成半筒形，立在培養(yǎng)皿中，原點(diǎn)應(yīng)在下端。取少量12%的氨水與小燒杯中，蓋好層析缸，平衡過(guò)夜。次日，取出氨水，加適量堿相溶劑(第一向)與培養(yǎng)皿中，蓋好層析缸，上行展層，當(dāng)溶劑前沿距濾紙上端1～2cm 時(shí)，取出濾紙，冷風(fēng)吹干。
將濾紙轉(zhuǎn)90 o ，再卷成半筒形，豎立在干凈培養(yǎng)皿中，并于小燒杯中至少量酸相溶劑，蓋好層析缸，平衡過(guò)夜，次日將加顯色劑的酸性溶劑(每10mL 展層劑加0.1～0.5mL 的顯色貯備液)傾入培養(yǎng)皿中，進(jìn)行第2向展層。展層畢，取出濾紙，用熱風(fēng)吹干，藍(lán)紫色斑點(diǎn)即顯現(xiàn)。
五、計(jì)算
單向?qū)游龅腞 f 值，按 “R f = 原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離”計(jì)量后計(jì)算。
雙向?qū)游鯮f 值，由兩個(gè)數(shù)值組成，在第一向計(jì)量一次，第二向計(jì)量一次，分別與已知的氨基酸在酸堿系統(tǒng)的Rf 值對(duì)比，即可初步?jīng)Q定它為何種氨基酸的斑點(diǎn)，將它剪下，在同一張紙剪下一塊大小相同的空白紙作為對(duì)照，用硫酸銅—乙醇溶液洗脫，用722型 分光光度計(jì) 測(cè)定其吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出 氨基酸 的含量。
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