核酸的定量測定——定磷法
[原理]
磷的測定方法很多，Fiske-Subbarow定磷法是一經典的但至今仍被經常采用的方法，它具有靈敏、簡便的特點。各種含磷有機物經硫酸或過氯酸水解，使有機磷消化成為無機磷。無機磷在酸性條件下，與鉬酸鹽（常用鉬酸銨或鉬酸鈉）反應生成磷鉬酸鹽絡合物。
用還原劑處理，磷鉬酸鹽絡合物被還原生成鉬藍，在660nm處有最大光吸收峰。在一定濃度范圍內，顏色的深淺與磷含量成正比關系。因此可應用分光光度法進行磷的定量測定。
化學反應式：
(NH 4 ) 2 MoO 4 + H 2 SO 4 → H 2 MoO 4 + (NH 4 ) 2 SO 4
H 3 PO 4 + 12H 2 MoO 4 → H 3 P (Mo 3 O 10 ) 4 + 12H 2 O
還原劑
H 3 P (Mo 3 O 10 ) 4 → Mo 2 O 3 MoO 3
核酸是一類含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般純的RNA及其核苷酸含磷質量分數為9.0%；DNA及其核苷酸含磷質量分數為9.2%，即每100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故測得磷的量，即可求得核酸量。這就是定磷法的理論依據，磷的定量測定是測定核酸含量常用手段之一。
生物有機磷材料中有時含有無機磷雜質，故用定磷法來測定該有機磷物質的量時，必須分別測定該樣品的總磷量，即樣品經過消化以后所測得的含磷量，以及該樣品的無機磷含量，即樣品未經消化直接測得的含磷量。將總磷量減去無機磷才是該有機磷物質的含磷量。
[方法和步驟]
1、 磷標準曲線的繪制
取試管7支，0～6依次編號。按下表加入各 試劑 。注意每加好一種 試劑 后應立即搖勻。
管號 名稱 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
標準磷溶液/mL | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 |
6 mol/L 硫酸/mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
25g/L鉬酸銨/mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
還原劑/mL | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
蒸餾水/mL | 3.9 | 3.4 | 2.9 | 2.4 | 1.9 | 1.4 | 0.9 |
各反應液加畢后，于30℃保溫20min，置分光光度計中在波長660nm比色，測光吸收值。以磷含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標作圖，即得定磷標準曲線。
2、總磷量的測定
取30毫升凱氏燒瓶2只，Ⅰ、Ⅱ依次編號，Ⅰ號瓶為空白對照，用刻度吸管準確吸取核糖核酸樣液1.0mL，置于Ⅱ號凱氏燒瓶內，Ⅰ號瓶加入蒸餾水1.0mL，不加樣液，兩瓶分別加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用小火加熱消化，待溶液呈褐色，稍加冷卻，加入2 mol/L硝酸2滴，再繼續加熱，直至逸出白色煙霧，溶液無色透明，表示消化完成時為止。
待凱氏燒瓶冷卻后，分別加入1.0mL蒸餾水，置沸水浴蒸煮5min，使焦磷酸分解。凱氏燒瓶從沸水浴中取出，待其冷卻，將Ⅰ和Ⅱ號瓶內的消化液分別移入兩只10毫升容量瓶中，用少量蒸餾水洗滌凱氏燒瓶兩次，并將洗滌液一并倒入容量瓶內，再各加蒸餾水稀釋至刻度。
取試管3支，按7～9依次編號，7號管為空白對照。
準確吸取空白對照液1.0mL，置于7號管內，再分別準確吸取Ⅱ號瓶經過消化的核糖核酸樣液1.0mL，置于8、9號管內，以下操作與磷標準曲線繪制相同。測出光密度，即可由繪制的標準曲線查得核糖核酸經消化稀釋后的總磷量。
3、無機磷的測定
取試管3支，按10～12依次編號，10號管為空白對照。
用刻度吸管分別準確吸取未經消化的核糖核酸液1.0mL，作為無機磷測定樣液，置于11、12號管內，空白管以蒸餾水代替RNA液，以下操作與磷標準曲線繪制相同。測出光密度，即可由繪制的標準曲線查得無機磷含量。若溶液渾濁，影響測定光密度，可在加入試劑搖勻后，進行過濾或置 離心機 3 000r/min離心15min，取其上清液再測定。
4、有機磷的測定
按上述方法分別測得總磷和無機磷的光密度，自總磷的光密度扣除無機磷的光密度，即為消化稀釋后樣液有機磷的光密度。
再由磷標準曲線查得有機磷含量。
[計算結果]
計算樣品中核酸的含量。
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