控制菌檢查法

控制菌檢查法是檢查供試品中是否有特定微生物，比如大腸埃希菌，沙門菌與銅綠假單胞菌等，這些菌種是致病菌或者有致病菌種存在的指示菌，其存在對(duì)藥物的安全性造成了極大的影響，因此需要控制為不得檢出。大腸埃希菌是非無(wú)菌制劑控制最常見(jiàn)的控制菌，其本身并不是致病菌，但其存在表明藥品很有可能被危險(xiǎn)性更大的沙門菌等污染，以下關(guān)于控制菌檢查法的討論皆以大腸埃希菌為例。

1.與微生物計(jì)數(shù)法的不同

控制菌檢查法類似于微生物計(jì)數(shù)法，但因其本身特點(diǎn)，其檢查也有很大的不同之處。其主要特點(diǎn)是控制菌要求不得檢出，所以一般情況下，即使有控制菌污染，檢出量應(yīng)該也較低，如果直接檢測(cè)，有可能因?yàn)榱刻俣旒訇幮裕孕枰靡后w培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)目標(biāo)菌生長(zhǎng)，對(duì)菌液進(jìn)行“富集”，便于檢測(cè)，液體培養(yǎng)基“富集”的過(guò)程除了能培養(yǎng)目標(biāo)菌外，還要求對(duì)其他干擾菌有抑制作用；“富集”后，接種至固體培養(yǎng)基上，與其他干擾菌分離后，進(jìn)行特異性反應(yīng)（如大腸埃希菌若有檢出顯紅色或粉紅色）確認(rèn)是否檢出。

供試液制備（1∶10供試液）→增菌培養(yǎng)（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）→選擇(麥康凱液體培養(yǎng)基)→分離(麥康凱固體培養(yǎng)基)是控制菌檢查法(大腸埃希菌檢查)的基本邏輯。相對(duì)于微生物計(jì)數(shù)法來(lái)說(shuō)（詳見(jiàn)微生物三部曲之一：微生物計(jì)數(shù)法），供試液制備和增菌培養(yǎng)基本同微生物計(jì)數(shù)法，控制菌檢查法多了選擇和分離兩個(gè)步驟。

2.麥康凱液體培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基需要有促生長(zhǎng)能力，同時(shí)，一些與目標(biāo)菌不同的菌也會(huì)生長(zhǎng)，這些菌的存在有可能會(huì)干擾目標(biāo)菌的檢測(cè)，液體培養(yǎng)基不僅需要對(duì)目標(biāo)菌有促生長(zhǎng)能力，對(duì)干擾菌還需要有抑制能力，大腸埃希菌(革蘭氏陰性菌)檢測(cè)時(shí)，所用的麥康凱液體培養(yǎng)基對(duì)大腸埃希菌有促生長(zhǎng)能力，對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制能力。金黃色葡萄球菌作為常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌，生長(zhǎng)速度快，其存在可能會(huì)掩蓋目標(biāo)菌，檢測(cè)大腸埃希菌時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行抑制，降低金黃色葡萄球菌的“噪音”，提高大腸埃希菌檢測(cè)的可能性。

麥康凱液體培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用的原因是培養(yǎng)基中含有膽鹽，金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)細(xì)胞沒(méi)有外膜保護(hù)，易被膽鹽破壞，而大腸埃希菌(革蘭氏陰性菌)細(xì)胞外膜可以起到保護(hù)作用。

液體培養(yǎng)基培養(yǎng)富集后，需要?jiǎng)澗€接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)，劃線接種是一種菌種分離手段，取麥康凱液體培養(yǎng)物涂在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，然后劃線使培養(yǎng)物分散，旋轉(zhuǎn)角度往不同的方向繼續(xù)劃線，培養(yǎng)物濃度越來(lái)越低，與此同時(shí)也達(dá)到了分離的目的，最后一次劃線得到了單個(gè)大腸埃希菌菌落，用于檢測(cè)。劃線接種的目的類似于，在一堆沙子中，有一些金子，最后通過(guò)劃線，將沙子不停的分散，最后能夠得到單個(gè)金粒。

大腸埃希菌所用的固體培養(yǎng)基為麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，不僅對(duì)大腸埃希菌有促生長(zhǎng)能力，還具有指示特性，即大腸埃希菌在該固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，會(huì)產(chǎn)生紅色或粉紅色菌落，這是乳糖發(fā)酵后產(chǎn)生的特異性顏色，其作用原理為麥康凱瓊脂培養(yǎng)基含有中性紅，大腸埃希菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，中性紅在酸性條件下變成紅色或粉紅色，所以具有指示性作用。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基里也含有結(jié)晶紫，可以進(jìn)一步抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的干擾。

大腸埃希菌檢測(cè)方法通過(guò)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的干擾，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使中性紅變成紅色或粉紅色而進(jìn)行確定，能夠發(fā)酵乳糖的常見(jiàn)革蘭氏陰性菌并不多見(jiàn)，所以方法具有很強(qiáng)的專屬性，但也有一些非常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌如克雷伯菌會(huì)造成干擾，所以檢測(cè)結(jié)果如有菌落生長(zhǎng)，需要對(duì)其進(jìn)行鑒定是否為大腸埃希菌。

3.陰性對(duì)照

除把供試液換成稀釋液外，其余操作均同供試液，要求陰性對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)，以防檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。

4.培養(yǎng)基適用性檢查

考察除樣品外對(duì)整個(gè)方法的影響。

(1)麥康凱液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力

接種不大于100cfu的大腸埃希菌于麥康凱液體培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基(一般從中檢院購(gòu)買)中，在42~44℃培養(yǎng)最多24小時(shí)，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。

(2)麥康凱液體培養(yǎng)基抑制能力

接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于麥康凱液體培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在42~44℃培養(yǎng)最少48小時(shí)，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌不得生長(zhǎng)。

(3)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力

用涂布法接種不大于100cfu的大腸埃希菌于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在30~35℃培養(yǎng)最多18小時(shí)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。

(4)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基指示特性

用涂布法接種不大于100cfu的大腸埃希菌于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在30~35℃培養(yǎng)最多18小時(shí)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征與對(duì)照培養(yǎng)基一致，且被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基均顯紅色或粉紅色。

5.方法適用性試驗(yàn)

主要考察樣品對(duì)檢測(cè)方法的影響。

可取1:10供試液10ml(含有1g藥物)，加入不大于100cfu的大腸埃希菌，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，在30~35℃下培養(yǎng)不超過(guò)18小時(shí)。后續(xù)繼續(xù)在麥康凱液體培養(yǎng)基中選擇，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)，應(yīng)能檢出。

如果未檢出，標(biāo)準(zhǔn)藥物可能有抑菌作用，需要加入中和劑。此時(shí)需要考察中和劑對(duì)大腸埃希菌的抑制作用。

或者采用薄膜過(guò)濾法，取10ml供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入大腸埃希菌，再接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。后續(xù)選擇和分離，應(yīng)能檢出。

6.供試品檢測(cè)

根據(jù)方法適用性確認(rèn)的方法，配制1:10供試液，取10ml，直接接種或過(guò)濾接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，取1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，于42-44℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，于30-35℃培養(yǎng)18-72小時(shí)。

應(yīng)不得檢出，如有檢出，需要進(jìn)行鑒定，該微生物不得為大腸埃希菌，且不得為其他不可接受菌。