該技術(shù)的改良階段體現(xiàn)了科學(xué)研究的接力協(xié)作。格拉姆的原始方法僅包含初染、媒染、脫色三步，未能使脫色后的陰性菌顯色，這一關(guān)鍵缺陷在數(shù)年后由德國(guó)病理學(xué)家Carl Weigert通過引入沙黃復(fù)染步驟得以彌補(bǔ)，從而形成了如今完整的四步染色法（初染-媒染-脫色-復(fù)染），使未保留紫色的細(xì)菌呈現(xiàn)紅色，實(shí)現(xiàn)了革蘭陽(yáng)性與陰性菌的清晰區(qū)分。

    在19世紀(jì)細(xì)菌分類學(xué)初創(chuàng)期，革蘭氏染色技術(shù)的定型為微生物學(xué)研究提供了關(guān)鍵工具。當(dāng)時(shí)微生物學(xué)正致力于建立病原菌與疾病的關(guān)聯(lián)，該技術(shù)憑借對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁特性的差異化染色能力，成為細(xì)菌分類的重要依據(jù)，直接推動(dòng)了“病原菌-疾病關(guān)聯(lián)”認(rèn)知的深化。盡管格拉姆本人未獲得諾貝爾獎(jiǎng)，但其開創(chuàng)的技術(shù)經(jīng)過后續(xù)研究者的完善，最終成為醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，至今仍在細(xì)菌鑒定、感染性疾病診斷中發(fā)揮核心作用。

結(jié)晶紫（Crystal Violet）

    關(guān)于革蘭氏染色化學(xué)機(jī)制已在1983年由戴維斯等人得到確定。在水溶液中，結(jié)晶紫分解為CV+和CL-離子，這些離子能夠穿透革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。CV+與細(xì)菌細(xì)胞中的負(fù)電荷成分相互作用，使細(xì)胞呈現(xiàn)紫色。當(dāng)加入碘(I-或者I3-）時(shí)，它與CV+結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外層形成大型CVI復(fù)合物。脫色劑(乙醇或乙醇和丙酮溶液)與革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生相互作用。革蘭氏陰性菌的外膜從細(xì)胞上脫落，使肽聚糖層暴露出來。革蘭氏陰性菌具有一到三層較薄的肽聚糖層，其結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖稍有不同。經(jīng)過乙醇處理，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁變得有滲透性，從而使得大型CVI復(fù)合物能夠從細(xì)胞中被洗脫。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞高度交聯(lián)的多層肽聚糖在加入乙醇后被脫水。肽聚糖的多層結(jié)構(gòu)與乙醇處理導(dǎo)致的脫水作用共同作用，將大型 CVI復(fù)合體困在細(xì)胞內(nèi)。脫色后，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞仍保持紫色外觀，而革蘭氏陰性細(xì)胞則失去紫色，在帶正電荷的染料番紅后才會(huì)顯現(xiàn)出來。在革蘭氏染色完成時(shí)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞呈紫色，而革蘭氏陰性細(xì)胞則為粉色至紅色。

革蘭氏染色鏡檢圖（左圖為G?，右圖為G?）

    一些細(xì)菌在革蘭氏染色后呈現(xiàn)出所謂的“革蘭氏可變”模式，目即可見到粉色和紫色的混合細(xì)胞。某些屬，如放線菌屬、關(guān)節(jié)桿菌屬、棒狀桿菌屬、分枝桿菌屬和丙酸桿菌屬，其細(xì)胞壁在細(xì)胞分裂過程中特別容易破裂，導(dǎo)致這些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)出革蘭氏陰性染色。此外，在所有使用革蘭氏染色法染色的細(xì)菌中，培養(yǎng)的年齡可能會(huì)影響染色結(jié)果。之前的文章對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行過詳細(xì)分析革蘭氏染色中的“變色龍”。