蛋白質(zhì)的疏水層析純化步驟
疏 水 層 析
1、 疏水層析是根據(jù)不同蛋白質(zhì)的疏水力強(qiáng)弱不同來(lái)分離的。
在高鹽離子強(qiáng)度的情況下，蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)充分暴露與填料的疏水介質(zhì)相互作用，從而結(jié)合在柱子上。
不同蛋白質(zhì)的疏水性強(qiáng)弱不同從而導(dǎo)致其與柱子填料的結(jié)合力也不同。隨后，逐漸降低洗脫緩沖液的鹽離子強(qiáng)度就可以將不同的蛋白分布洗脫下來(lái)，形成一個(gè)個(gè)的蛋白質(zhì)洗脫峰。
2、 柱子的裝填：如果是預(yù)裝柱，就不存在裝柱的問(wèn)題了。
不是，則從頭開(kāi)始：首先，把柱子洗干凈，一定要洗干凈，不然會(huì)出現(xiàn)氣泡。
填料預(yù)先融漲（注意，進(jìn)口一般已經(jīng)是融漲好的，不必再做這一步），取一定的填料（例如：想裝5.0ml的柱子，一般將瓶子里的填料（沉淀的填料：上清=1：1的話）取10.0ml出來(lái)）先脫一下氣（控制不好會(huì)暴沸出來(lái)），然后緩緩裝入柱子（柱子上下口一定不要搞錯(cuò)），打開(kāi)下口讓水流出，最好一次性裝完，等待其自然沉降，柱子就裝好了。
（實(shí)際上，因?yàn)槭杷畬游龅脑砼c分子篩不同，所以其裝柱遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有分子篩的柱子那么嚴(yán)格，很容易
3、 注意：柱子裝好之后，任何時(shí)間都不能讓緩沖液流到柱面以下而干柱！
4、 緩沖液的選擇：
a、pH值：要在蛋白質(zhì)的pI值附近，因?yàn)檫@時(shí)蛋白質(zhì)的疏水力會(huì)最強(qiáng)，但是也不要把緩沖液的pH正好調(diào)到pI，因?yàn)榈鞍啄菚r(shí)會(huì)發(fā)生等電點(diǎn)沉淀！。所以，如果你的蛋白等電點(diǎn)是8.5的話，配一個(gè)8.0或9.0的緩沖液應(yīng)該都可以！
b、緩沖介質(zhì)：常用的是PBS或者Tris-HCl緩沖液，都可以，看個(gè)人習(xí)慣了，或者，你以后的實(shí)驗(yàn)要用Tris-HCl，那么這里也用Tris-HCl就是了。蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)上用的是PBS，自行選擇。
c、緩沖液的濃度：依照蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)上的濃度即可：20mM。
5、 樣品的處理：疏水層析是在高鹽離子強(qiáng)度的情況下上樣的。而且，樣品在上樣之前一定要注意沒(méi)有沉淀，有的話應(yīng)該離心除去。樣品的鹽離子強(qiáng)度的調(diào)整：可以直接將固體的磨的很細(xì)的鹽顆粒加在樣品里，使之達(dá)到預(yù)定的濃度（是硫酸銨的話，就查手冊(cè)后面的表格，計(jì)算應(yīng)該加多少鹽），或者將樣品與100%的硫酸銨等體積混合，不就變成50%的了（這樣的好處是緩沖液的濃度不會(huì)因?yàn)榧尤肓蛩徜@體積變大而降低，從而影響了樣品的pH值）
還有更加重要的是：請(qǐng)仔細(xì)選擇上樣的離子強(qiáng)度，要知道，蛋白質(zhì)在高鹽的情況下是要發(fā)生沉淀的（硫酸銨沉淀純化蛋白的原理）！如果你的蛋白的硫酸銨沉淀范圍是50-80%，那么你大可放心地用50%硫酸銨來(lái)上樣！如果你的蛋白的硫酸銨沉淀范圍是30-50%，那么你就只能用30%來(lái)上樣了，千萬(wàn)記住！！！還有就是，調(diào)整鹽離子強(qiáng)度的時(shí)候要在低溫下操作，如果有沉淀產(chǎn)生，輕輕地混勻一會(huì)兒，該溶解的就會(huì)溶解，離一下心，就可以上樣了。
6、 不知道你的蛋白的穩(wěn)定性如何？必要的時(shí)候，請(qǐng)加入蛋白酶抑制劑。
7、 柱子的預(yù)平衡：10倍床體積的層析緩沖液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸銨（這個(gè)濃度要你選擇，50%還是30%？）），使其平衡。
8、 上樣：當(dāng)平衡層析緩沖液流至恰好與床面相切時(shí)，關(guān)閉出液口（有泵的話，把它一關(guān)就OK!），然后上樣。注意：盡量小心，保持床面的平整性！打開(kāi)出口，讓樣品緩緩進(jìn)入柱床，再次相切時(shí)，加入少量（很少就可以，稍稍蓋過(guò)床面就行！）層析緩沖液（20mM PBS, 50%硫酸銨）洗一下。
9、 洗柱：注意，這一步不是洗脫，而是把一些吸附不在柱子上的雜蛋白盡量洗下來(lái)！步驟：3倍床體積的層析緩沖液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸銨）洗柱或者觀察檢測(cè)儀的信號(hào)回到基線，那就證明吸不住的雜蛋白完全洗下來(lái)了。
10、 目的蛋白的洗脫：有梯度混合儀的話，可以梯度洗脫（比如50%-0%洗脫），沒(méi)有的話，就像手冊(cè)上那樣，配置一系列濃度的洗脫緩沖液，各兩倍體積來(lái)洗。
控制好流速，0.5ml/min左右吧，再問(wèn)問(wèn)人家一般用多大的流速？?jī)煞N洗脫方式各有利弊，梯度洗脫分辨率高一些，操作較簡(jiǎn)單，不用頻繁更換緩沖液，但是不太適合批量蛋白的過(guò)柱。分布洗脫比較煩，要不停更換緩沖液（換液之前，別忘了關(guān)泵，否則柱子要被吸），但是批量操作性好，重復(fù)性好，樣品可以不用分步收集，只需把不同濃度緩沖液洗下來(lái)的樣品收集到一起即可。
11、 樣品的收集：梯度洗脫的話，將洗脫峰的各管合并（不放心，可以峰前，峰尖，峰尾分別合并，至少可能保證峰尖是純的，不過(guò)我覺(jué)得你的樣品沒(méi)必要這樣，因?yàn)楸緛?lái)就比較純的！）分布洗脫的話，本來(lái)就是直接按照不同濃度合并收集的，不存在再次合并問(wèn)題。
12、 樣品純度的檢查：疏水層析后的樣品鹽離子強(qiáng)度很高的一般都，除非你是在0%的時(shí)候才洗脫下來(lái)你的蛋白（還有，如果你的蛋白0%還洗不下來(lái)，可以在洗脫緩沖液中加入5%的乙醇或者乙二醇來(lái)洗脫）。不管用什么辦法，請(qǐng)將你的樣品脫鹽（透析，體積太大可以先冷凍干燥再溶解后透析，或者直接用三氯乙酸沉淀洗滌即可）。然后，估計(jì)一下你的樣品的蛋白質(zhì)濃度，就可以SDS-PAGE上樣電泳檢查純度了（測(cè)酶活方便的話，比較比酶活也可以初步知道純化程度！）。若純度要求很高，你可以用銀染來(lái)檢查，這個(gè)靈敏度高，ng級(jí)的！
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